检测干细胞四唑盐比色法试验原理

检测干细胞四唑盐比色法试验原理
此法的原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中，而干细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用酶联免疫检测，以在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反应活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。
●0.25%胰蛋白酶消化细胞使其成为单细胞，用含0.1%胎牛血清的RPMI培养基配成1x10^9个/L的但细胞悬液，将细胞接种于96孔培养板中，每孔100ul。
●将培养板置CO2培养箱中，在37℃、5%CO2条件下，培养3-5天。
●培养3-5天后，每孔加入MTT溶液10ul，继续置培养箱孵育3-6h，终止培养，加10%SDS-HCl 100ul/孔，37℃培养数小时，将细胞内与细胞周围的MTT颗粒充分溶解。
●用酶联免疫检测仪测定每孔吸光度（OD），选波长490nm。以时间为横轴，OD值为纵轴绘制细胞生长曲线。
用此法测干细胞活力，为保证结果的准确性，在试验前测定每种细胞的贴比率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，再确定每孔细胞接种数和培养时间，以保证培养终止时不会过满。另外，实验时设空白对照，比色时，以空白孔调零。
3.2.2 CCK-8 法
Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
● 制备细胞悬液：细胞计数
● 接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。
● 37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。
●加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK8的培养基，以换液的形式加入。
●培养1-4小时:干细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认*条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。
●测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。