肿瘤细胞间相互作用影响iPSc的成熟实验

肿瘤细胞经典四步法诱导iPSc肝分化 从生长状态良好的iPSc中去除分化的细胞, 用胰蛋白酶消化成单细胞, 接种至基质胶包被好的细胞培养皿上, 用Duncan的四步法进行肝细胞定向诱导分化。

1 材料与方法

1.1 细胞培养将iPSc接种在基质胶(matrigel)包被的细胞培养皿上, 用经典多能干细胞无滋养层培养基培养。细胞达70%汇合后, 先用4型胶原酶消化, 然后机械切割成小的细胞团块传代。

1.2 诱导iPSc肝分化

1.2.1 经典四步法诱导iPSc肝分化 从生长状态良好的iPSc中去除分化的细胞, 用胰蛋白酶消化成单细胞, 接种至基质胶包被好的细胞培养皿上, 用 Duncan的四步法进行肝细胞定向诱导分化。*阶段为内胚层诱导阶段, 分为a诱导和b诱导, a诱导过程2d, 培养基为1640中添加2%B27、100 ng/mLActivin A、10ng/mLBMP4(bone morphogenetic protein 4)和 20 ng/mL FGF2(fibroblast growth factor 2)。b诱导过程2 d, 培养基与a诱导所用相似, 不再添加BMP4和 FGF2。第二阶段为肝细胞定向诱导阶段, 共5 d, 培养基为1640中添加2%的B27、100 ng/mL Activin A、 20 ng/mL BMP4和10 ng/mL FGF2。第三阶段为不成熟肝细胞诱导阶段, 共5 d, 培养基为1640中添加2% B27和20 ng/mL HGF。第四阶段为成熟肝细胞诱导阶段, 培养基为商品化成熟肝细胞培养基(Invitrogen 公司 )加入 20 ng/mL的抑瘤素 M(oncostatin-M, OSM)。每阶段分化后收获细胞, 免疫荧光检测蛋白质水平, RT-PCR检测mRNA水平。

1.2.2 消化传代破坏细胞连接 分别在第二阶段和第三阶段诱导结束, 胰蛋白酶消化破坏细胞连接。再次接种至基质胶包被的细胞皿中, 分别进行第三和第四阶段诱导。阶段诱导分化结束后收获细胞, 免疫荧光检测蛋白质水平, RT-PCR检测mRNA 水平, 比较经典诱导成熟和消化传代处理细胞间的差异。

1.3 免疫荧光和RT-PCR检验分化指标将未分化的iPSc接种至24孔板中免疫荧光检测胚胎阶段特异性抗原4(stage-specific embryonic antigen 4, SSEA4)和肿瘤识别抗原 -1-81(tumor recognition antigen-1-81, TRA-1-81)。免疫荧光检测分化蛋白质变化。在分化过程中, 每一分化阶段结束时收获细胞, 一部分固定于玻片上, 进行免疫荧光染色 (计数1×105 细胞, 使用cytospin离心机于1 500 r/min室温离心4 min, 细胞贴附于玻片上, 行固定、染色)。

在*阶段和第二阶段结束时, 分别检测SOX17(sex determining region Y-box 17)和HNF4A的表达, 通过 SOX17和HNF4A的阳性率鉴定本次分化的效果, 第二阶段结束时两者阳性率大于60%, AFP和ALB的表达为阴性, 进行下阶段诱导分化。第三和第四阶段分化结束时, 比较2种方法所得细胞AFP和ALB 阳性细胞百分率的差异。RT-PCR检验分化过程中特异指标mRNA变化。在每一阶段完成时, 收获细胞 提 取mRNA, 检 测AFP(alpha-fetoprotein)、ALB、 GATA结合蛋白6(GATA binding protein 6, GATA6)和 HNF4A变化情况, 以原代肝细胞为对照, 统计2种方法所得细胞mRNA水平的差异。

AFP引物-F: 5'-GCA GAG GAG ATG TGC TGG ATT G-3', AFP引物-R: 5'-CGT GGT CAG TTT GCA GCA TTC TG-3'; ALB 引物-F: 5'-GAT GAG ATG CCT GCT GAC TTG C-3', ALB引物-R: 5'-CAC GAC AGA GTA ATC AGG ATG CC-3'; GATA6引物-F: 5'-GCC ACT ACC TGT GCA ACG CCT-3', GATA6引物-R: 5'-CAA TCC AAG CCG CCG TGA TGA A-3'; HNF4A引物-F: 5'-GGT GTC CAT ACG CAT CCT TGA C-3', HNF4A引物-R: 5'- AGC CGC TTG ATC TTC CCT GGA T-3'。

1.4 数据统计对于免疫荧光染色结果, 肿瘤细胞每分化组随机计数3 个视野中阳性细胞所占比率, 用均值±标准差来表示zui终结果, 用均值进行卡方检验比较组间差异, P<0.05为存在显著性差异。对于RT-PCR结果, t检验比较组间差异, P<0.05为存在显著性差异。
助壮素    Mepiquat chloride    高纯，99%    1克
猪胆酸钠    Cholic aicd sodium Salt    CP，98%    100克
珠光脂酸    Heptadecanoic acid    SP，99.8%    25克
朱砂    Chinese red    CP    50毫升
重组人粒细胞集落刺激因子    rhG-CSF    BR，98.5%    1克
重组人甲状旁腺激素1-84    PTH1-84    BR，98%    1克
重组人甲状旁腺激素1-34    PTH1-34    BR，95%    500毫克
重组人白细胞介素-1受体拮抗剂    rhIL-1ra    BR    500克
重组蚂蟥素    Hirudin recombinant    BR，98%    100克
重碳酸钠    Sodium hydrogen carboante    光谱级，99.8%    100毫克
肿瘤细胞