蛋白酶抑制剂混合物片剂(无EDTA)操作步骤

蛋白酶抑制剂混合物片剂(无EDTA)操作步骤：

1  切取含有目的DNA 片段的琼脂糖凝胶条带。

● 尽量切除不含有目的DNA 部分的凝胶，减少凝胶体积，提高DNA 回收率。

● 切胶时，请使用长波长UV  （360 nm ）光盒。且不要将DNA 长时间暴露在紫外灯下，以防DNA 损伤。

2  称取凝胶的重量近似地确定其体积。

● 凝胶重量的称量方法：取1.5 ml 离心管电子天平称初质量，切胶装在离心管后称终质量，两者差即为胶的质量。不同离心管的重量可能有差异，因此，每个离心管的重量需单独称量。

3  按照每100 mg 琼脂糖凝胶对应100 µl 溶液BD 的比例，向离心管中加入溶液BD。

4  50 ℃水浴7-10min，直至凝胶*溶化。期间需要振荡混合3 次。

● 琼脂糖必须*融化，以免堵塞柱子，严重影响DNA 片段的回收效率。

● 如果总体积大于500 µl，可适当增加溶胶时间。

● 若此时溶液变红，可加10 µl 3M NaAC  （pH 5.2）。

5  将步骤4 所获溶液置于DNA 纯化柱中，静置2min 。

● 胶块*溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为纯化柱在较高温度时结合DNA  的能力较弱。

6  12,000 rpm 离心1min。若溶液量大于DNA 纯化柱的容积，可分两次离心，弃滤液。

● 此时DNA 片段被吸附于DNA 纯化柱中的硅胶膜上。

7  加入500 µl 溶液BD。12,000 rpm,  离心1min，弃滤液

8  加入500 µl 溶液PE。12,000 rpm,  离心1min，弃滤液。

● 溶液PE 初次使用前用无水乙醇按1: 4 稀释，即含80% 乙醇。

● 此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量DNA 片段。

9  加入500 µl 溶液PE。12,000 rpm,  离心1min，弃滤液。

10 12,000 rpm 离心  3min ，以*去除纯化柱中的液体。

● 此步骤的作用是去除残留乙醇，避免残留乙醇影响后续酶促反应。同时也利于DNA 片段的充分溶解。

11  将离心柱置于新的1.5 ml 离心管中。向纯化柱的中央处，悬空滴加30-100 µl 溶液Eluent  （60℃预热），静置2min 。12,000 rpm  离心1min，管底即为目的DNA 片段。贮存于-20℃。

● 溶液Eluent 可用无菌双蒸水代替，但其pH 需为8.0-8.5，加入体积视DNA 目的片段的多少、用户对目的片段浓度要求而定。

● 对溶液Eluent 60℃预热，会提高提取DNA 目的片段的产量。

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