肾透明细胞腺癌细胞；769-P操作步骤

肾透明细胞腺癌细胞；769-P操作步骤:

1、贴壁细胞的消化

①吸除培养液，用无菌 PBS、Hanks 液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清。

②加入少量生物 Trypsin-EDTA solution，略盖过细胞即可，室温放置 0.5～2min， 不同的细胞消化时间有所不同。

③显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变

化；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来，吸除细胞消化液。加入含血清的  *细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验。

④如果发现消化不足，则加入 Trypsin-EDTA solution 重新消化。

⑤如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落， 直接用细胞培养液把细胞全部吹打下来。1000～2000g 离心 1min，沉淀细胞，尽量去除细胞消化液后，加入含血清的*培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。

2、组织的消化不同的组织需要消化的时间相差很大，通常以消化后可以充分打散组织为宜。

免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。