细胞核分离实验中常见问题有哪些

分离失败通常源于‌样品质量、操作细节或设备问题‌，下面梳理了关键点：

一、样品相关问题

‌细胞状态差‌：死细胞或受损细胞比例高会释放大量杂质，干扰分离。

‌起始细胞量不足‌：样品量太少导致最终得率极低，难以检测。

‌组织处理不当‌：组织样本若未充分均质化或消化，会影响细胞核释放效率。

二、操作过程问题

‌裂解不充分或过度‌：

‌不充分‌：细胞膜未破裂，核释放不。

‌过度‌：破坏核膜完整性，导致核碎片化。

‌离心参数不匹配‌：

‌转速/时间不足‌：核无法沉淀，留在上清中。

‌转速/时间过长‌：可能导致核膜破裂或杂质共沉淀。

‌温度控制不当‌：未在4℃低温操作，激活核酸酶降解DNA/RNA。

‌缓冲液问题‌：

‌成分错误‌：如缺乏蛋白酶抑制剂或RNase抑制剂。

‌pH值不准‌：影响核稳定性。

‌反复冻融‌：破坏缓冲液平衡。

三、设备与耗材问题

‌离心机校准偏差‌：实际转速与设定值不符，影响分离效果。

‌转子或离心管不匹配‌：使用不能承受高转速的耗材，导致破裂或泄漏。

‌设备未预冷‌：离心腔或转子未提前至4℃，造成温度波动。

四、其他常见问题

‌样品粘稠度高‌：未充分稀释或DNase处理，导致沉淀不均一。

‌交叉污染‌：移液枪头、离心管等未更换，造成样品间污染。

‌缺乏预实验优化‌：未针对特定细胞类型优化裂解和离心条件。

‌优化建议‌：设置阳性对照（如已知分离良好的样本），每步操作后取样镜检，优化时每次只改变一个变量。