荧光探针PCR试剂盒的基本原理是什么？

　　荧光探针PCR试剂盒(Fluorescence Probe-based PCR Kit)是一种在​​实时定量聚合酶链式反应（Real-Time Quantitative PCR，简称qPCR 或 RT-qPCR）​​中广泛使用的检测工具，其核心是通过​​荧光信号的变化实时监测PCR扩增过程​​，从而实现对目标核酸(DNA或cDNA)的​​定性检测、定量分析以及灵敏度的检测​​。
  

　　下面从基本原理、关键组成、工作流程与技术特点等方面详细阐述荧光探针PCR试剂盒的基本原理。
 

　　一、基本原理概述
 

　　荧光探针PCR试剂盒的基本原理是：
 

　　​​在常规PCR反应的基础上，引入一种特异性荧光标记的探针，在PCR扩增过程中，该探针与目标DNA模板特异性结合，并在DNA聚合酶的作用下被切割，释放出荧光信号；通过实时检测荧光信号的强度变化，从而实现对目标核酸的定量或定性分析。​​
 

　　简单来说，就是：
 

　　​​有目标核酸 → PCR扩增 → 探针结合并被切割 → 荧光信号增强 → 信号与核酸量成正比 → 定量/定性判断。​​
 

　　二、荧光探针PCR vs 常规PCR
  

　　三、荧光探针PCR试剂盒的关键组成
 

　　一个典型的荧光探针PCR试剂盒通常包含以下核心试剂和成分：
 

　　​​引物（Primers）​​
 

　　一对特异性寡核苷酸序列，用于扩增目标DNA的特定区域；
 

　　设计需高度特异，以确保只扩增目标序列。
 

　　​​荧光探针（Fluorescent Probe）​​
 

　　是荧光探针PCR的核心元件，一般为​​寡核苷酸探针​​，长度通常为20~30个碱基；
 

　　探针特异性结合在​​目标DNA序列的引物扩增区域之间​​；
 

　　探针本身带有：
 

　　​​报告基团（Reporter, R）​​：发荧光基团(如FAM、HEX、ROX等)；
 

　　​​淬灭基团（Quencher, Q）​​：吸收报告基团荧光的基团(如TAMRA、BHQ等)；
 

　　🔬 ​​关键机制：在完整状态下，报告基团与淬灭基团靠近，荧光被淬灭几乎无信号；当探针被DNA聚合酶切割后，两者分离，荧光信号释放并增强。​​
 

　　​​DNA聚合酶（如Taq酶）​​
 

　　具有5'→3'聚合活性和​​5'→3'外切酶活性（关键！）​​，用于切割探针；
 

　　是实现“探针切割→荧光释放”的必要条件。
 

　　​​dNTPs​​
 

　　包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP，为PCR扩增提供原料。
 

　　​​PCR反应缓冲体系​​
 

　　提供适宜的pH、Mg²⁺浓度等，保障PCR反应高效进行。
 

　　​​阳性对照 / 阴性对照 / 内参（可选）​​
 

　　用于质控实验是否正常，判断结果的可靠性。
 

　　四、荧光探针PCR的工作流程与原理详解
 

　　Step 1：反应体系配制
 

　　将目标核酸模板(如DNA或cDNA)、引物、荧光探针、Taq酶、dNTPs、缓冲液等混合，构成完整的PCR反应体系。
 

　　Step 2：PCR扩增循环(在实时荧光PCR仪中进行)
 

　　PCR过程一般分为三个步骤，循环进行(通常30~45个循环)：
 

　　​​变性（Denaturation）​​：94–95°C，约10~30秒
 

　　→ 双链DNA解开成单链，为引物和探针结合提供模板。
 

　　​​退火（Annealing）​​：50–65°C(依引物Tm值而定)，约20~30秒
 

　　→ 引物和荧光探针特异性地结合到目标DNA序列的对应区域上。
 

　　🔹 探针此时完整地结合在目标序列上，报告基团与淬灭基团靠近，​​荧光几乎不释放​​。
 

　　​​延伸（Extension）​​：72°C，约30~60秒
 

　　→ ​​Taq酶从引物3'端开始合成新链，同时其5'→3'外切酶活性将探针从5'端逐步“切割”下来。​​
 

　　🔹 ​​探针被切断后，报告基团与淬灭基团分离 → 荧光信号释放！​​
 

　　🎯 ​​每成功扩增一个目标DNA分子，就会产生一个探针切割事件 → 释放一份荧光信号。​​
 

　　Step 3：实时检测荧光信号
 

　　PCR仪器会在每个循环的延伸阶段或之后检测荧光强度；
 

　　随着循环数增加，目标DNA数量呈指数增长 → 荧光信号也逐步增强；
 

　　通过检测​​荧光信号的增长曲线​​，可以实时反映PCR产物的积累过程。
 

　　五、荧光信号与目标核酸量的关系
 

　　在PCR初期(循环数较少时)，目标DNA少，荧光信号微弱，处于​​基线期（Baseline）​​；
 

　　当目标DNA达到一定数量后，荧光信号显著上升，进入​​指数扩增期（Exponential Phase）​​；
 

　　最终进入平台期(Plateau)，反应试剂耗尽，信号趋于平稳。
 

　　🔍 ​​Ct值（Cycle Threshold）​​：
 

　　是指荧光信号超过背景阈值时的PCR循环数；
 

　　​​Ct值与起始模板量成反比​​：起始模板越多，Ct值越小；反之则越大；
 

　　通过Ct值可对样本中的目标核酸进行​​相对或绝对定量分析​​。
 

　　六、常见的荧光探针类型

类型	说明	应用
​​TaqMan 探针​​	最常见，5'报告基团 + 3'淬灭基团，依赖Taq酶5'→3'外切酶活性切割	病原检测、基因表达、SNP分型等
​​分子信标（Molecular Beacon）​​	发夹型探针，依靠自身结构实现淬灭，与目标结合后构象改变释放荧光	实时监测、SNP分析
​​FRET探针（荧光共振能量转移）​​	双探针系统，能量从供体转移到受体，切割后能量传递中断	多重检测、高特异性需求场景

 

　　其中，​​TaqMan探针是常用的一种，也是大多数商用荧光PCR试剂盒所采用的方案。​​
 

　　七、荧光探针PCR试剂盒的典型应用
 

　　​​病原微生物检测​​
 

　　新冠病毒(SARS-CoV-2)、乙肝病毒(HBV)、HPV、结核杆菌等核酸检测；
 

　　​​基因表达分析​​
 

　　检测特定mRNA的表达水平，研究基因功能；
 

　　​​转基因检测 / 动植物疫病检测​​
 

　　检测特定基因序列是否存在；
 

　　​​SNP（单核苷酸多态性）分析​​
 

　　基因分型、个体化用药指导；
 

　　​​肿瘤相关基因检测​​
 

　　如EGFR突变、KRAS突变等；
 

　　​​食品安全与动物源性检测​​
 

　　检测肉类掺假、致病菌污染等。
 

　　八、总结：荧光探针PCR试剂盒基本原理一句话概括
 

　　​​荧光探针PCR试剂盒通过在PCR反应体系中引入特异性荧光标记探针，在DNA扩增过程中利用Taq酶切割探针释放荧光信号，从而实现对目标核酸的实时监测、高灵敏度与高特异性的定性与定量分析。​​