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冷冻保存细胞之方法？
冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃ 30~60 分钟→ （-20 ℃30 分钟*） → -80 ℃16~18 小时（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 长期储存。
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 ℃不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

产品属性：

名称    兔骨内膜间充质干细胞
2.组织来源：股骨、胫骨

3.产品规格：5×105cells/T25细胞培养瓶

4.细胞简介：

兔骨内膜间充质干细胞分离自股骨、胫骨；骨内膜是一层致密结缔组织膜，覆盖在骨的表面（关节面除外），新鲜骨内膜呈粉红色，含有丰富的血管、神经和成骨细胞。此外，附着于骨的肌腱、韧带于附着部位都与骨内膜编织在一起。因而骨内膜与骨质结合甚为牢固。骨内膜富含血管、神经，通过骨质的滋养孔分布于骨质和骨髓。骨内膜分内、外两层，外层主要是粗大的胶原纤维束，部分纤维穿入骨质，使骨内膜固定于骨面；内层疏松，含成骨细胞和破骨细胞（分别具有产生新骨质和改建骨的功能）。骨髓腔和骨松质的网眼也衬着一层菲薄的结缔组织膜，叫做骨膜。骨内膜的内层和骨膜有分化成骨细胞和破骨细胞的能力，以形成新骨质和破坏、改造已生成的骨质，所以对骨的发生、生长、修复等具有重要意义。骨内膜间充质干细胞是一种具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞，可以向骨、软骨、肌组织、皮肤、脂肪、神经等多种组织分化，因此可以作为组织工程中的种子细胞。骨内膜间充质干细胞的体外培养条件要求较高，在培养过程中，受贴壁时间、种植密度、血清含量、培养温度和培养基pH值等条件的影响。

5.方法简介：

公司实验室分离的兔骨内膜间充质干细胞采用冲洗骨髓、消化骨内膜、差速贴壁法结合培养基筛选制备而来，细胞总量约为5×10?cells/瓶。

6.质量检测：

公司实验室分离的兔骨内膜间充质干细胞经CD90免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

7.培养信息：

培养基 含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 成纤维细胞样

传代特性 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液 0.25%

培养条件 气相：空气，95%；CO2，5%

培养操作：
1）复苏细胞：将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加 入 4mL 培养基混合均 匀。在 1000RPM 条件下离心 4 分钟，弃去上清液，补 加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培 养过夜（或将 细胞悬液加入 10cm 皿中，加入约 8ml 培养基，培养过夜）。第二天换液并 检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。
1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。
2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于 37℃培 养箱中消化 1-2 分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分 变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养 瓶后加少量培养基终止消 化。
3. 按 6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 4 分 钟，弃去上清液，补加 1-2mL 培养液后吹匀。
4. 将细胞悬液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为类；
1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml ，细胞变圆 脱 落后，加入 1ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。加 1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量加 入血 清和 DMSO，轻轻混匀，DMSO 终浓度为 10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存 1ml 细胞悬液，注意冻 存管做好标识。
3. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80 度冰箱，2 个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
核突触蛋白α抗体

自噬相关蛋白4B抗体

整合素样金属蛋白酶与凝血酶1型-12抗体

AP2关联激酶1抗体

水通道蛋白1抗体
大鼠钙非依赖性磷脂酶A2(iPLA2)elisa检测试剂盒

大鼠钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱγ(CAMK2γ)elisa检测试剂盒

大鼠钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱα(CAMK2α)elisa检测试剂盒

大鼠复制蛋白A1(RPA1)elisa检测试剂盒

大鼠辅肌动蛋白α2(ACTN2)elisa检测试剂盒
兔骨内膜间充质干细胞离子结合型果胶（ISP）含量测试盒

丽春红染色液 100ml

氨基肽酶（LAP）测试盒

含量测试盒

亮绿/灿烂绿染色液(Brilliant Green,2%)100ml
实验报告：
产品仅用于科研一、分离与培养：
1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将成1mm3左右大小；
2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；
3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织*被消化；
4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；
5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；
二、免疫荧光鉴定：
1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；
2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；
4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；
5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；
6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。