肿瘤细胞培养递送siRNA*方法

由于肿瘤细胞使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。而siRNA转染途径也是一种常用的RNAi技术，那么本文在此介绍向培养细胞递送siRNA的*化方法。以下的所有建议适用于siRNA，确切地说，同样可用于递送siRNA模拟物/抑制剂。

(1)进行实验时要保持一致

条件优化后，应注意确保操作中每一步的顺序、时间和方式一致。 整个实验中变动因素越少，实验结果的可重复性及可靠性越高。

(2)转染时选择恰当的顺序

标准的转染操作中，须在转染前约24小时细胞铺板。 反向转染操作中，细胞铺板和转染可同时进行，操作上节省了一整天的时间。 Ambion公司的科学家发现，在的反向转染操作中(例如使用RNAiMax)：某些细胞系转染效率稍高;siRNA的浓度通常会有所降低(这可能会降低脱靶效应);更广泛浓度范围内的细胞都可成功使用。

(3)选用*密度的健康细胞

细胞的汇合度应为40–80%，并且传代次数较低(比如小于50次)，即细胞不可太老。 随着时间的推移，相对于较早传代的细胞，培养细胞的表型和生长特性通常会呈多样变化，这也会体现在表达谱中。

在培养条件影响下(例如频繁的温度和pH值变化、过度培养时培养基中的营养不足、继代培养时细胞密度太低、胰蛋白酶连续处理、激烈吹打或离心时的剪切力以及支原体污染)，许多细胞的表达谱会发生改变。 每孔的细胞太少或太多，也会影响转染效率。 根据转染容器的表面积，尝试不同的细胞密度，比如设置低、中、高密度的孔。

(4)选择恰当的培养基和培养条件

使用*的组织培养操作方法。 siRNA递送过程中，抗生素不是必需的，细胞吸收抗生素后可能会增加毒性。此外，一些siRNA转染试剂要求在无血清或低血清的培养基中转染，所以一定要注意的建议。选择恰当的细胞培养基(例如某些细胞需要更多的葡萄糖或氨基酸)。

(5)选用高质量siRNA，使用zui低有效浓度

siRNA中应不含从合成过程带来的试剂(例如乙醇或盐)。 长于30bp的双链RNA污染物可通过激活非特异性的干扰素反应，产生细胞毒性，从而改变基因的表达。 Ambion公司标准纯度的siRNA没有此类污染物，非常适合细胞培养实验。 在优化递送条件的实验中，确定选用的方法和细胞类型所需siRNA的zui低有效浓度，过量使用siRNA会增加非特异性(脱靶)效应。

(6)使用siRNA阳性和阴性对照以及未处理的样品来监测每次实验的siRNA递送

每次实验必须包含siRNA阴性和阳性对照，以便监测siRNA的递送效率(即比较siRNA阳性对照处理的和siRNA阴性对照处理的细胞靶标基因的表达水平)。 在多数经验证的siRNA调控和细胞体系中，可看到mRNA调控靶标抑制效率高于≥70%。 此外，应通过比较siRNA阴性对照和未处理的样品中培养的细胞活性来监测siRNA递送过程的细胞毒性。

(7)优化转染试剂选择和剂量

不同细胞系和细胞类型的转染难度差别很大。 RNAiMax转染试剂能够有效地将小RNA递送到各种细胞中，而且细胞毒性非常小。

对于难转染的肿瘤细胞系(如悬浮细胞、血液细胞、原代细胞和神经细胞)，某公司的科学家们建议在不同的浓度下至少尝试2种不同的转染试剂。转染试剂剂量不足会影响siRNA递送和基因沉默效果，过多则会有细胞毒性。根据不同的细胞类型，需要不同数量的转染试剂。

如果转染结果不成功(基因抑制和/或细胞活性差)，可考虑采用电转化方法或病毒载体来递送siRNA。

(8)优化转染试剂/siRNA复合物接触时间：siRNA Complexes

转染效率受转染试剂/siRNA复合物的剂量影响。如果细胞毒性和靶基因抑制效率都很高，转染8–24小时后，可利用正常培养基更换含有转染试剂/siRNA复合物的培养基，从而降低细胞毒性并保持高的基因沉默效应。
YSRIBIO825    Lincomycin Hydrochloride     盐酸林可霉素标准品    7179-49-9     200mg
YSRIBIO826    Lidocaine     利多卡因标准品    137-58-6     250mg
YSRIBIO827    L-Histidine     L-组氨酸标准品    71-00-1     200mg
YSRIBIO828    L-Glutamic Acid Hydrochloride    L-谷氨酸盐酸盐标准品    138-15-8     100mg
YSRIBIO829    L-Fucose (AS)    L-岩藻糖标准品    2438-80-4     200mg
YSRIBIO830    Levothyroxine     左旋甲状腺素标准品    51-48-9     500mg
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