磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）样本的前处理

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器

或研钵匀浆。

2、 将匀浆 600g，4℃离心 5min。

3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 α-KGDH（此步可选做）。

5、 在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或

200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 α-KGDH 活性测定。

测定步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、 样本测定

（1）在试剂五中加入 18mL 试剂四充分溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）

水浴 10min；现配现用；

（2）在试剂六中加入 1mL 蒸馏水，充分溶解待用；现配现用；

（3）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、10μL 试剂六和 180μL 试剂五，混

匀，立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 2min20s 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。

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