贝类5羟色胺（5-HT）ELISA试剂盒操作注意事项

     在完成试剂配制和样本预处理后，需特别注意以下操作细节以确保检测准确性：

1. 加样标准化

使用多通道移液器时，建议提前校准移液头精度，每孔加样量误差需控制在±2%以内。对于高黏度贝类组织匀浆，建议采用反向吸液法，并在加样前用预冷PBS润洗枪头3次，避免样本挂壁导致的体积偏差。

2. 温育环境控制

37℃孵育阶段应使用具有主动循环功能的恒温箱，并在反应板表面覆盖密封膜时预留5mm透气边缝，防止冷凝水积聚。每30分钟人工摇板1次（振幅10cm，频率60次/分钟），可显著提高抗原抗体结合效率。

3. 洗板关键参数

自动洗板机建议设置"预洗-浸泡-终洗"三步程序：预洗液量300μL/孔（流速1mL/s），Tris缓冲液浸泡60秒，终洗采用脉冲式冲洗（5次×200μL/次）。手工洗板时需保持洗液注满板孔后静置90秒，弃液时板体倾斜45°角轻叩10次。

‌4. 显色终止时机

当标准品最高浓度孔OD值达到0.8-1.2时（波长450nm），应立即终止反应。对于富含黑色素的贻贝样本，建议在终止后30分钟内完成读数，并使用620nm参比波长校正浊度干扰。

5. 数据质控要点

每批次应包含3个质控样本：空白对照（零标准品）、基质加标回收样（80-120%回收率）、重复样（CV值<8%）。当标准曲线R²值<0.99时，需复核标准品梯度稀释步骤是否出现跳管污染。

特殊情况下（如检测扇贝生殖腺样本），可适当调整样本稀释倍数至1:5，并延长封闭时间至45分钟。所有操作需在避光环境下完成，避免5-HT光降解。实验结束后，剩余96孔板条应立即装入含干燥剂的铝箔袋，4℃保存不超过72小时。